بررسی اثرات ضد ميكروبی گياهان دم اسب و بومادران
گياهان هنوز يك منبـع بـالقوه تركيبـات دارويی هستند. در سراسر دنيا گياهـان بطورسنتی برای درمان بسياری از بيماری ها بـويژه بيماری هــای عفــونی مانند اســهال، تــب و ســرما خوردگی، همچنـين بـه منظـور كنتـرل زاد و ولـد، بهداشت دهان و دندان استفاده م يشوند.عـلاوه بــر آن بسـياری از تركيبــات روان گــردان استفاده شده در طب سـنتی ريشـه گيـاهی دارنـد. طبــق تعريــف ســازمان بهداشــت جهــانی، گياه دارويی، گياهی اسـت كـه بتـوان از آن برای اهـداف درمـانی اسـتفاده کـرد يـا ترکيبات آن را به عنوان پيشتاز در سنتز داروهای شيميايی نيمه صنعتی اسـتفاده کرد.
بررسی اثــرات فارمــاكولوژيكی
پنج روش مختلف برای انتخاب گياهان بـه منظـور بررســی اثــرات فارمــاكولوژيكی وجــود دارد کــه عبارتنــد از : Random approach كــه شــامل جمع آوری گياهان موجود در منطقه مـورد مطالعـه است، Phytochemical targeting كه شامل جمع آوری همه اعضاء يك خانواده گياهی است كه غنی بودن آنها از تركيبات بيولوژيك فعال اثبـات شده ، روش نمونه برداری Ethno-directed بر پايه اسـتفاده هـای دارويـی سـنتی از يـك گيـاه مـی باشــد. Chemotaxonomic approach و روش Specific plant parts كــه بــر اســاس جمع آوری قسمت های خـاص گيـاه ماننـد دانـه هـا می باشد. مطالعات زيادی بر روی عصـاره هـای تهيـه شـده از گياهـان جمـع آوری شـده بـه شـكل تصـادفی و يـا بـه يكـی از روش هـای فـوق انجـام گرفته است. اين مطالعات بيشتر بـر روی ارزيـابی اثرات ضد ميكروبی، ضد كرمی، ضــد ويروســی، اثــرات ســيتو توكســيته و موتاژنيســــــيته و همچنــــــين اثــــــرات فارماكولوژيكيی عمومی تمركز يافته است .
اسامی علمی
گياهــان بومــادران و دم اســب بــا اســامي علمــي Equisetum و arvense Achillea millefolium در طب سنتی به منظور اثرات گوناگونی مورد استفاده قرار مي گيرند. هدف از مطالعه اخير بررسی اثرات ضد باكتريايی، ضد قارچی و ضد ميكروبی گياهان دم اسب و بومادران دو گياه مزبوراست كـه بـدين منظـور اثـر عصـاره هـاي گوناگون آنها بر روي چند ميكـرو ارگـانيزم بطـور in vitro مورد بررسی قرار گرفت.
جمع آوری و فرآوری گياهان
برای یافتن اثرات ضد ميكروبی گياهان دم اسب و بومادران، گياهان مورد آزمـايش از بـاغ بوتانيـك دانشـكده داروسازي تبريز, بومادران در اوايـــل تيــر مـاه و دم اسب در اواخرخرداد جمع آوري و بـا توجـه بـه مشخصـــات گيـــاه شناســـي مربوطـــه شناســـايي گرديدند . قســمت مــورد اســتفاده گيــاه بومــادران، گل هــا و سرشاخه هاي گلدار آن بود. براي اين منظـور سـر شاخه هاي گلدار گياه بومادران جـدا و سـپس در سـايه و در دماي آزمايشگاه خشك شدند. در مورد گياه دم اسب، گل گياه مورد بررسي قرار گرفت كه پـس از جمـع آوري و تميـز نمـودن، در دماي آزمايشگاه و در سايه خشك گرديدند.
عصاره گيری
براي تهيه عصاره ها، ابتدا نمونه هـاي خشـك شـده توسـط آسـياب خـردكن پـودر گرديدنـد. عصـاره گيـري از نمونـه هـا بـه روش ماسراسـيون صـورت گرفــت. بــراي ايــن منظــور، از پــودر هــر يــك از گياهـان بـه ميـزان ٢٠٠ گـرم تـوزين كـرده و بـه داخل دو ارلـن جداگانـه دو ليتـري منتقـل شـدند . سپس روي پودرها، متانل %٧٠ ريختـه شـد. حجـم متانل مصرفي در اين مـورد بـراي پـودر بومـادران ١٢٠٠ ميلي ليتر و در مـورد دم اسـب ٧٠٠ ميلـي ليتر بود. پس از ٢٤ ساعت نمونه ها صاف شـدند و عمل استخراج سه بـار تكـرار گرديـد .
تکرار استخراج
در مراحـل تكرار استخراج، هر بار بـراي هـر يـك از گياهـان مقـدار ٥٠٠ ميلـي ليتـر متانـل %٧٠ اسـتفاده شـد. عصاره حاصل از هر مرحله جدا و بر روي هم جمع گرديدنـــد. ســـپس متانـــل موجـــود در عصـــاره هيدرومتانلي حاصـله توسـط اواپراتـور و در دمـاي ٦٠ درجه سانتيگراد خارج گرديد. بعد از اين مرحله، عصاره مائي بدست آمده توسط حلال هايي با قطبيت بالا رونده مورد اسـتخراج قـرار گرفتند. براي ايـن منظـور از دو حـلال كلروفـرم و اتيل استات استفاده شد.
دكانتاسـيون مكرر
ايـن كـار بـا دكانتاسـيون مكرر عصاره آبي توسط حلال هـاي فـوق بـا حجمـي معادل حجم عصاره مائي انجام شد. بدين ترتيب، در پايان براي هر نمونه گياهي سـه عصاره كلروفرمي، اتيل استاتی و مائي بدست آمـد. ســپس اقــدام بــه خشــك كــردن عصــاره هــاي كلروفرمي و اتيل استاتي توسط اپراتور بـه ترتيـب در دماي ٦٠ و ٧٠ درجـه سـانتي گـراد گرديدنـد. عصاره هاي آبي نيز در سيني هاي لعابي و در دماي آزمايشگاه و دور از نور خشـك شـدند . در نهايـت وزن خشك هر عصاره اندازه گيري و ثبت گرديد. برای بررسی اثرات ضد ميكروبي، هر عصاره در حداقل مقدار از حلال مربوطه حل گرديد و غلظت محلـول هـاي نهـايي محاسـبه شد.
آناليز ضد ميكروبی
ارزيــابی ضــد ميكروبــی in vitro عصــاره هــاي كلروفرمي، اتيل استاتي و مائي در مقابل پنج گونـه ميكرو ارگـانيزم شـامل يـك بـاكتري گـرم مثبـت اســــتافيلوكوك اورئــــوس ، دو باكتري گـرم منفـي اشرشـياكلي و پسـودوموناس آئروژينـوزا و دو گونه قارچ آسپرژيلوس نايجر و كانديدا آلبيكانس انجام گرفـت.
روش انجام
آمپول هاي ليوفليزه حاوي گونـه هـاي باكتريـايي و قارچي مزبور از پژوهشكده بيوتكنولوژي سـازمان پژوهش هاي علمي و صنعتي ايران تحويـل گرفتـه شد و بر اساس دستور العمل الحاقي فعال گرديد و محلـول اسـتوك از هركـدام بـراي اسـتفاده هـاي بعدي تهيه گرديد. بـه منظـور تهيـه اينوكولـوم در مورد گونه هاي باكتريايي، يك كلوني از هـر كـدام به ٥ ميلي ليتر محيط كشت نوترينت بـراث منتقـل شــد و انكوباســيون شــبانه آنهــا در دمــاي C ۳۷° انجام گرفت. در مورد گونه هاي قارچي، يك كلوني از هـر كـدام در ٥ ميلي ليتر محيط كشت نوترينت بـراث وارد گرديــد و بــه مــدت ٧٢‐٤٨ ســاعت در C۳۰° انكوبـه شـد. كشـت هـاي ميكربـي حاصـل، قبـل از استفاده براي آزمايش بـه نسـبت ١ بـه ١٠ رقيـق گرديدنـد.
روش انتشـار در آگـار بوسيله ديسك كاغذي
برای بررسـي اثـر ضـد ميكروبـي عصاره هاي گياهي از روش انتشـار در آگـار بوسيله ديسك كاغذي استفاده شد. جهـت تهيـه پليـت هـا مطـابق روش USP، در شـرايط اسـتريل ٢١ ميلـي ليتـر از محــيط كشــت مولرهينــون آگــار بــه داخــل پليــت استريل ريخته شد. بعـد از انجمـاد ، محـيط كشـت ريخته شده در پليت كـه لايـه پايـه ناميـده ميشود به مقـدار١ ميلـي ليتـر از اينوكولـوم تهيـه شده به ٤ ميلي ليتر محيط كشـت مولرهينتـون كـه دماي آن به C۴۵° رسانده شده بود اضافه گرديد و محيط كشت حاصل به روي لايه پايه افزوده شـد كه به اين لايه، لايه بذرگفته مي شود. از هر كدام از ٥ ميكروارگانيزم ياد شـده و بـراي هـر يـك از ٦ عصاره موجود، پليت جداگانه تهيه گرديـد كـه در جمع ٣٠ پليت بدست آمـد . از محلـول هـاي اوليـه هــر كدام از عصاره ها , رقت هايي با نسـبت هـاي ١ به ٥ و ١ بـه ٢٥ تهيـه شـد .
تعداد عصاره ها
بنـابراين بـراي هـر گياه, سه عصاره و از هر عصاره سه محلـول شـامل محلولي بـا غلظـت اوليـه و دو محلـول رقيـق شـده مورد بررسي قرار گرفت. اين محلول ها به ترتيب محلول هاي شماره1، 2 و 3 نام گذاري شدند. تعدادي ديسك هـاي كاغـذي تهيـه شـده از كاغـذ واتمن به قطر٥ ميلي متر كه قبل از استفاده داخـل اتوكلاو استريل گرديدند، به ترتيب داخل هر يك ازمحلول هاي مزبور خيسانده شدند . ديسـك هـاي حـاوي حـلال هـاي كلروفـرم، اتيـل استات و آب مقطر استريل نيز به عنوان شـاهد در هر يك از پليت ها قرار داده شدند. از ديسك هاي آنتي بيوتيك آميكاسـين بـراي ميكـرو اورگـانيزم استافيـلوكـــــوس اورئـــوس، جنتاماســين بــراي ميكـــرو اورگـــانيزم هـــاي اشريشـــيا كلـــي و پســودوموناس آئروژينــوزا و ونكومايســين بــراي ميكــــرو اورگــــانيزم كانديــــدا آلبيكــــانس و آسپرژيلوس نايجربـه منظـور كنتـرل در پليـت هـا استفاده گرديد.
زمان انکوبه
پليت ها به منظور انتشار بيشتر عصـاره هـاي مـورد آزمايش در آگار ابتدا به مدت ٥ ساعت انکوبه شدند و سپس پليت هاي حـاوي باكتري هـا به مدت ٢٤ ساعت در دماي C۳۷° و پليت هـاي حاوي قارچ ها به مـدت ٧٢‐ ٤٨ سـاعت در دمـاي C۳۷° انكوبــه گرديدنــد. پــس از انكوباســيون، پليت هاي مورد آزمايش از لحاظ وجود هالـه عـدم رشد در اطراف ديسك هاي حاوي عصاره بررسـي شده و قطر هاله هاي بوجود آمـده انـدازه گيـري و ثبت گرديد. به منظـور اطمينـان بـه نتـايج حاصـل، آزمايش مزبور يكبار ديگر تكرار گرديد.
نتیجه
بـا توجه به نتايج بدست آمده از آزمايشـات ضـد ميكروبي بر روي عصاره هاي گياهان دم اسب و بومادران، نكات زير قابل ذكر مي باشد:
- بیشترین اثر مهاري بر روي رشد ميكروارگانيسم مربوط به اثر فاز كلروفرمي آشـيلاميلفوليوم بـر روي استافيلوكوكوس اورئوس مـي باشـد. قطـر هالـه عـدم رشد در اين مورد براي محلول شماره1، ١٥ميلي متر و براي محلول شماره٢، حدود ١١ميلـي متـر بـود. در اطراف ديسك مربوط به محلول شماره ٣ هالـه عـدم رشد مشاهده نگرديد.
- در اطــــراف ديسـك محلــــول شماره ١عصاره اتيـل اسـتاتي آشـيلاميلفوليوم هاله اي به قطـر ٩ميلـي متـر از عـدم رشـد ميكـروب در پليـت اســتافيلوكوكوس اورئــوس مشــاهده شد. رشــد ميكروارگانيســم در حــول ديسك هــاي مربــوط بــه محلول هاي٢ و٣ يكنواخت و مانند بقيه نقاط بود.
- در اطراف ديسك محلول شماره١عصاره اتيل استاتي اكويستوم آرونس در پليت حاوي باكتري استافيلوكوكوس اورئوس هاله عدم رشد به قطر ٩ ميلـي متر مشاهده شد. در محلول هاي بعدي اثـر ضـد ميكروبي مشاهده نشد.
هاله عدم رشد
4 . هاله عدم رشدي به قطر ٩ ميلـي متـر در اطـراف ديسك محلول شماره ١ عصاره كلروفرمـي اكويسـتوم آرونس بـر روي اسـتافيلوكوكوس اورئـوس مشـاهده گرديد. رشد ميكروب در اطراف ديسك هاي متعلـق به رقت هاي بعدي طبيعي و فاقد هاله بودند.
5. در اطراف ديســـك محلــول شــماره١ عصــاره كلروفرمــي آشــيلاميلفوليوم در پليـــت مربــوط بـــه آسپرژيلوس نايجر هاله اي بقطر ٩ ميلي متر از كاهش رشد ميكروارگانيسم مشاهده شد. بنظر ميرسد عصاره، توانايي متوقف كردن رشد قـارچ را نداشت ولي از سرعت رشد آن در نفـوذ و انتشار خودش به طرز محسوسـي کم شد كـه باعث ايجاد هاله مهار رشد نسبي قارچ گردید.
- در مورد آسپرژيلوس نايجر، اثر فاز مايي عصاره آشيلاميلفوليوم است كه باعث تقويت محسوس و معني دار رشد قارچ در اطراف ديسك شد. اين افزايش رشد قارچ در اطراف ديسك مربوط به محلول شماره 2، اندكي كمتر و در اطراف ديسك محلول شماره٣ ناچيز و غير محسوس است. بعد از هاله رشد شديد، يك هاله رشد كم و يا عدم رشد نسبي ديده مي شود كه به دليل تراكم متابوليت هاي ناشي از رشد فراوان قارچ در همان ناحيه است كه حالت توكسيك می باشد.
7. رشد ميكروارگانيسم هـادرحوالي ديسك هاي مربوط به حلال ها (آب مقطر استريل، كلروفرم و اتيل اســتات) در تمام پليت هـا طبيعي بود ،بــدون تغييــر خاصی نسبت بـه بقيـه نقـاط صـورت گرفت.
نکته
8. بغير از موارد مذكور در كليه ٣٠ پليت آزمايش، هيچگونه تغييري در رشـد ميكروارگانيسم ها در حضــور عصاره هــا مشاهده نگرديد.
9. بـراي مـوارد مثبـت، آزمـايش مجـدد بـه منظـور بررسي صحت نتايج حاصـله انجـام گرفـت كـه نتـايج مذكور تاييد گرديد.
مشاهدات
مطالعه حاضر در مورد اثرات ضد ميكروبی گياهان دم اسب و بومادران نشـان مي دهـد كـه از بـين عصاره هاي مائي، كلروفرمـي و اتيـل اسـتاتي بيشترين اثرات مربوط به عصاره هـاي كلروفرمي و بـر روي ميكـرو ارگـانيزم استافيلوكوكوس اورئوس مي باشد. اثر مهاري عصـاره كلروفرمي گياه بومـادران، بـارزتر است و در محلـول شماره۱ و ۲ اين اثرات مشـاهده شد. در مورد گياه دم اسب در محلول شـماره ۱ از عصـاره كلروفرمـي, عـدم رشد وجود دارد . عصاره هـاي اتيـل اسـتاتي دو گياه مورد آزمايش بر اسـتافيلوكوك اورئـوس اثـرات يكسـاني را نشـان مي دهـد ولـی در ممـوع، اثـرات ضعيف تر از اثرات عصاره كلروفرمـي گیاه بومادران است.
منبع:
فتحی آزاد، فاطمه، و لطفی پور، فرزانه. (1383). بررسی اثرات ضد میکروبی گیاهان دم اسب و بومادران . علوم دارویی (pharmaceutical sciences)، 10(1)، 37-46. SID. https://sid.ir/paper/48576/fa