مقایسه پروتئومیکس کندروسیت غضروف بیماران مبتلا به استئوآرتریت با غضروف طبیعی

استئوآرتريت (OA) شايع ترين بيماري دژنراتيو مفصلي و مهم ترين علت ناتواني بيماران مسن مي باشد. دژنراسيون غضروف مفصل همراه با تغييرات در استخوان زير غضروف، تصوير بارز استئوآرتريت مي باشد.

كيفيت زندگي با استئوآرتريت 

استئوآرتريت از لحاظ اثر بر روي كيفيت زندگي و ناتواني مزمن، مهمترين علت بعد از علل قلبي- عروقي است. در حدود 3/1 بيماران بالاي 35 سال استئوآرتريت را در طول زندگي خود تجربه خواهند كرد. غضروف نرمال سطح صاف و صيقلي دارد، عصب، لنف و رگ خوني ندارد. حفظ غضروف توسط سلول هاي اختصاصي كندروسيت است كه تقريبا 2 درصد حجم غضروف را در افراد بالغ شامل مي شود.  ماتريكس غضروف به طور اساسي از:

• كلاژن ها (اغلب كلاژن نوع II  و به مقدار كمتر از ديگر كلاژن ها)
• پروتئوگليكان ها
• آگريكان

تشكيل شده است. تخريب غضروف در OA شامل تخريب در ماكرومولكول هاي ماتريكس و تغيير در بروز پروتئين هاي كندروسيت است. تغييرات دژنراتيو باعث توليد كلاژن و قطعات پروتئوگليكان مي شود كه بيوماركرهاي بالقوه در خون، مايع سينوويال و ادرار هستند كه تشخيص داده شد.

معرفی پروتئوميكس

پروتئوميكس نوعي مطالعه سيستماتيك تمام پروتئين هايي است كه در يك سلول، بافت و يا موجود زنده بيان مي شوند. در مقايسه با چهل هزار ژن موجود در ژنوم انسان، بيش از پانصد هزار پروتئين، محتواي پروتئيني انسان را تشكيل مي دهند، كه به صورت آزاد در مايعات بيولوژيك، متصل به غشا و يا درون سلول وجود دارند.  واژه پروتئوميكس در اوايل دهه 1990 ميلادي ابداع شد. بعدا با پيشرفت هايي كه در الكتروفورز دو بعدي (2-DE) و ژل الكتروفورز فلورسانت حاصل شد، اين علم نيز پيشرفت كرد. 2D- DIGE نوع پيشرفته (2- DE) مي باشد. در اين روش گروه ليزين روي پروتئين ها با سيانين 3 و 5 فلورسنت نشان دار مي شوند.

سپس، نمونه ها روي ژل نوع 2D الكتروفورز مي شوند كه امكان مقايسه كمي مستقيم در يك ژل و امكان مقايسه كمي ميزان پروتئين هاي بين ژل ها را فراهم مي كند.

پیشرفت های اصلی

پيشرفت هاي اصلي در 2D- DIGE در حساسيت و امكان تكرارپذيري آن و طيف گسترده ديناميك بودن آن است.  روش MALDI یک روش قوي براي تعيين پروتئين هاي مربوط به بيماري ها است. با توجه به افزايش شيوع استئوآرتريت، اقدامات چندگانه ضروري و مورد نياز است؛ از جمله كمپين هاي آموزشي براي پيشگيري از استئوآرتريت و تأمين بودجه تحقيقات براي شناسايي درماني كه علل را به جاي علائم استئوآرتريت مورد توجه قرار دهند. امروزه، هيچ داروي موثر بر فعاليت اين بيماري شناسايي نشده است.

كشف بيوماركرها

بدون شك، كشف بيوماركرها در اوايل تشخيص استئوآرتريت كمك به شناسايي درمان دارويي جديد با هدف توقف استئوآرتريت قبل از آن كه غيرقابل برگشت شود، خواهند بود. در عمل بيوماركرها به پزشكان در جهت نظارت بر پيشرفت استئوآرتريت و ارزيابي اثر بخشي درمان با قابليت اطمينان بيش از انجام تصويربرداري كمك خواهد كرد. اكثريت بيوماركرها پروتئين ها و متابوليت هاي بيوشيميايي هستند. هدف از اين مطالعه بررسي پروتئين هاي تغيير يافته در كندروسيت بيماران مبتلا به OA در مراحل انتهايي بيماري با غضروف نرمال مي باشد.  مشخص كردن اين پروتئين ها مي تواند در گسترش علم در فرآيند پاتولوژيك آسيب غضروف مفصل و تشخيص و درمان بر اساس پاتولوژي بيماري كمك خواهد كرد.

تشخيص استئوآرتريت شديد هيپ و يا زانو بیماران

در اين مطالعه با طراحي مقطعي 10 بيمار با تشخيص استئوآرتريت شديد هيپ و يا زانو با توجه به شواهد كلينيكي و راديولوژيك (بر اساس معيارهاي انجمن روماتولوژيك آمريكا) كه كانديد عمل آرتروپلاستي كامل مفصل هيپ يا زانو بودند، انتخاب شد. در زمان انجام عمل آرتروپلاستي:

• مفصل 10 نمونه از غضروف با استئوآرتريت و 10 نمونه از غضروف همان بيمار كه در ظاهر سالم بود، همزمان تهيه شد.
• قبل از عمل جراحي و نمونه گيري رضايت بيماران به طور كتبي جلب گرديد.
• بعد از شستشو دادن سطح غضروف با نرمال سالين، از چاقوي جراحي براي بريدن يك قطعه موازي به اندازه ي 5 در 5 ميليمتر از سطح غضروف و عمق آن تا حدود استخوان زير غضروف برداشته شده است.
• نمونه بلافاصله درون نيتروژن مايع قرار گرفت تا الگوي پروتئيني آن تغيير نكند.
• در مرحله ي بعد با جداسازي كندروسيت ها و كشت آنها در محيط كشت، امكان مطالعه فراهم گرديد.
• وارد مرحله آماده سازي نمونه جهت به دست آوردن رسوب پروتئيني شديم.

نیازمندی ها

اين مرحله به دستگاه هايي چون سانتريفيوژ يخچال دار (4 درجه) جهت جلوگيري از به هم پيوستن پروتئين ها در دور بالا و نيز هموژنايزر نياز داشت. بافت غضروفي تهيه شده از مفاصل سالم و مبتلا در اندازه هاي 2×2×2 ميليمتر تقسيم شده و به مدت 4 روز با حدود 12 ميلي ليتر بافر قرار داده شد. مخلوط به دست آمده به مدت 5 دقيقه در دماي 4 درجه با سرعت 3000 دور در دقيقه تحت سانتريفوژ قرار گرفت. پس از:

• انجام سانتريفيوژ
• تهيه رسوب پروتئيني
• غلظت آن را با سنجش برادفورد و به كمك دستگاه UV  اسپكتروسكوپي محاسبه كرده است.
• وارد مراحل پروتئوميكس

شديم. هدف از مطالعه يك پروتئوم، معمولا تفكيك و نمايش محصولات پروتئيني موجود در نمونه است؛ بنابراين به منظور دستيابي به حداكثر ميزان تفكيك، روش الكتروفورز دوبعدي (2- DE)  ابداع شده است.

آزمایشات مطالعه

در اين مطالعه 10 بيمار مبتلا به استئوآرتريت زانو و هيپ شناخته شده بر اساس معيارهاي انجمن روماتولوژي آمريكا  كه با توجه به شدت استئوآرتريت در راديوگرافي و معاينه باليني انديكاسيون عمل جراحي آرتروپلاستي داشتند، وارد مطالعه شدند. از اين تعداد بيمار، 20 نمونه (10 نمونه از قسمت غضروف با ظاهر ماكروسكوپي سالم و 10 نمونه از قسمت غضروف با ظاهر ماكروسكوپي مبتلا به استئوآرتريت) جهت بررسي هاي پروتئو ميكس در حين عمل جراحي گرفته شد. تعداد 2 نمونه به علت ناكافي بودن ميزان بافت و يك نمونه به علت اشكال در انتقال از مطالعه حذف شدند. از 7 نمونه بافت بيماران مورد مطالعه، 5 نفر زن (71 درصد) و 2 نفر مرد (29 درصد) بودند. ميانگين سني بيماران 7/64 سال و ميانگين طول مدت بيماري آنها 28/6 سال بود.

درگيري مفصل زانو بیماران

درگيري مفصل زانو در 4 بيمار و درگيري مفصل هيپ در 3 بيمار وجود داشت. شكايت اصلي تمام بيماران (100 درصد) درد بوده و حدود 42 درصد بيماران (3 نفر) از تورم مفصل شكايت داشتند كه بيشتر تورم مفصل زانو بوده است. در اين مطالعه نقشه پروتئوميكس كندروسيت هاي غضروف سالم و مبتلا به استئوآرتريت مقايسه گرديد. در كل در اين مطالعه:

• حدود 25 لكه پروتئيني پس از انجام مطالعات بيوانفورماتيك بر روي ژل به دست آمد.
• جهت تسهيل آناليز نتايج حاصله نمونه هاي هر 7 ژل با يكديگر مطابقت داده شد.
• پروتئين هايي كه در بيش از 3 نمونه از بيماران يا افراد سالم بروز داده شده بود، به عنوان فراوانترين پروتئين هاي موجود در نمونه ها گزارش شد.

از طرفي در نمونه هاي نرمال و بيمار پروتئين هايي كه بروز كمتري (كاهش سطح در بيش از 3 نمونه) و كاهش شديد نشان دادند، به عنوان كمترين پروتئين هاي موجود گزارش شدند.

نتایج بررسی ها

در اين مطالعه از بين 25 پروتئين كه بر اساس وزن مولكولي و   pH ايزوالكتريك آناليز شدند، تعداد 8 پروتئين شامل پروتئين هاي استئونكتين، كلاسترين، كاتپسين، كلاژن تيپ 2، كندروادهرين، كربنيك انهيدراز، اكتيوين A و HSP بين دو نمونه اختلاف داشتند . سطح پروتئين هاي استئونكتين، كلاسترين، كاتپسين و كلاژن تيپ 2 در نمونه هاي مبتلا به استئوآرتريت نسبت به نمونه هاي سالم كاهش يافته و سطح پلي پپتيد كندروادهرين افزايش بارزي در نمونه هاي مبتلا داشت.

نتایج یافته های اصلی

همچنين، يافته اصلي اين مطالعه كاهش سطح پپتيد اكتيوين A در غضروف نرمال در هر 7 نمونه و غلظت بالاي اين پپتيد در غضروف مبتلا به استئوآرتريت بود. در اين مطالعه با توجه به نحوه انجام سانتريفوژ با دور بالا، تمامي مولكول هاي كلاژن به ويژه تيپ 2 از نقشه پروتئومي غضروف مبتلا و سالم حذف شدند. وجود Heat shock protein در نمونه هاي مبتلا به استئوآرتريت نشانه نقش بالاي اين پروتئين در فرآيندهاي التهابي مفصلي بود. كندروادهرين از پپتيدهايي است كه در اين مطالعه در بررسي مقايسه اي غضروف هاي نرمال در فقط 2 نمونه جمع آوري شده روي ژل الكتروفورز مشهود بود و در گروه Absent قرار گرفت. نكته جالب اين مطالعه عدم وجود مولكول آنزيمي انهيدراز كربنيك در غضروف مفصلي مبتلايان به استئوآرتريت بود.

مطالعات اخیر

تمركز مطالعات در سال هاي اخير بر شناسايي ماركرهاي بيوشيمي جديد در بيماري ها جهت تسهيل شناسايي اوليه و بهبود درمان است. پيشرفت در پروتئوميكس و تكنيك هاي تحليلي، فرصت هاي جديدي را براي به دست آوردن بينش نسبت به عملكرد مايعات بيولوژيك كمپلكس در وضعيت سلامت و بيماري فراهم كرد. برخي از مطالعات مشخصات ترشحي غضروف طبيعي و غضروف در بيماران استئوآرتريت را با  (2-DE) و MS آناليز كرده اند. محققین پروتئوم كندروسيت هاي مفصلي نرمال را به منظور ايجاد يك ابزار جديد براي مطالعه OA  توصيف كرده اند. در مطالعات مختلف به بررسي پروتئوم كندروسيت هاي غضروف طبيعي در مقابل استئو آرتريت با استفاده از (2-DE) پرداخته شد. در مطالعه حاضر متوجه كاهش سطح آنزيمي كربنيك انهيدراز و حضور كلاژن تيپ 2 ، كندروادهرين، اكتيوين A و HSP در سطح ژل الكتروفورز شديم. كلاژن نوع 2 احتمالا ايده آل ترين نشانگر براي مطالعه بازسازي غضروف است.

فراوانترين پروتئين در غضروف

فراوانترين پروتئين در غضروف، نمايانگر 25 درصد از وزن تر، 50 درصد از وزن خشك، و 90-95 درصد از كل محتواي كلاژن غضروف است. كلاژن نوع 2 تنها 1 درصد از همه كلاژن بدن را مي سازد و تغيير و تبديل نرمال آن كم است، اما در موارد پاتولوژيك در مفصل، انتظار ميرود با بالارفتن سطح اپيتوپ هاي كلاژن باعث بهبود روند پاتولوژي شود. از آنجا كه كلاژن نوع 2 خاص غضروف هيالن است و به وفور در اين بافت يافت شد، عمده بيوماركر تغيير و تبديل غضروف، اپيتوپ هاي مشتق شده از كلاژن نوع 2 است.

افزايش خون و ادرار در مبتلايان به استئوآرتريت

حتي در مبتلايان به استئوآرتريت سطح اين كلاژن در تمام بدن از جمله خون و ادرار افزايش مي يابد و اندازه گيري كلاژن نوع 2 ادرار ممكن است به شناسايي بيماران مبتلا به استئوآرتريت با تغيير و تبديل بالاي غضروف كمك كند، و اين بيماران به احتمال زياد بيشترين پاسخ را به درمان با داروهاي اصلاح ساختار نشان ميدهند. دانشمندان بیان کردند  كه كلاژن تيپ 2 در بيماران مبتلا به استئوآرتريت افزايش مي يابد كه در راستاي مطالعه حاضر است.

مطالعه حاضر در زمینه فرآيند سانتريفيوژ

از آنجا كه در مطالعه حاضر طي فرآيند سانتريفيوژ با سرعت 3000 دور در دقيقه و در دماي 4 درجه بخش اعظم مولكول هاي كلاژن تيپ 2 از مجموع نمونه ها حذف شدند، اما غلظت بالاي اين پپتيد در مبتلايان به استئوآرتريت باعث شد كه عليرغم حذف اين مولكول از نمونه ها همچنان در سطح پائين گزارش شد.

معرفی پروتئین HSP

HSP پروتئين نگهباني است كه با ارسال سيگنال به سلول ها جهت توليد 1IGF و IL -1B در تنظيم بيان پروتئين MMP (Matrix Metalo Proteinase) كه پروتئين اصلي در ساختمان غضروف براي ساخت كلاژن ميباشد، نقش مهمي در بهبود فرآيندهاي التهابي در ساختمان غضروف مفاصل آسيب ديده ايفا می کند.  Activin A در مكان التهاب است كه در بهبود زخم در موش نقش دارد.

افزايش متوسط بيان ژن كلاژن II و سنتز پروتئو گليكان در كندروسيت

همچنين، باعث افزايش متوسط بيان ژن كلاژن II و سنتز پروتئو گليكان در كندروسيت مي شود. اين پروتئين يك هموديمر دو زنجيرهاي از Inhibin β  است و عضو اصلي خانواده β -TGF است كه در اصل از مايع فوليكولي تخمدان تخليص شد.

معرفی Activin

Activin مي تواند باعث تمايز سلول هاي مزانشيمي يا به عبارت ديگر كندروژنزيس شده و به عنوان يك سيتوكين بسيار مهم در فرايند آنتي كاتابوليك غضروف عمل كند. همچنين، نقش آن در بهبود زخم نيز ثابت شده است. در اين مطالعه افزايش اين پروتئين در بيماران مشاهده شد.

مطالعه حاضر

در مطالعه حاضر كربنيك انهيدراز در بيماران كاهش يافته بود. كربنيك انهيدراز یک، هيدراتاسيون دي اكسيد كربن را كاتاليز مي كند و منجر به سنتز بيكربنات مي شود. اين آنزيم در فعاليت هاي فيزيولوژيك و پاتولوژيك كلسيفيكاسيون و معدني شدن استخوان شركت مي كند.

اين نتايج نشان داد كه:

1 CA نه تنها باعث افزايش واكنش هيدراتاسيون دي اكسيد كربن مي شود، بلكه تركيب بيكربنات با كلسيم را نيز پيش برد و رسوب جامد كربنات كلسيم تشکیل داد. بنابراين، افزايش بيان 1 CA در سينوويوم بيماران ممكن است به رسوب 3  CaCO دربافت هاي بيمار فرد منجر شود.

كاتپسين

يك پروتئاز اسيدي كه عضوي از خانواده پپتيدازهاي آسپارتيك محسوب شده و فراوان ترين پروتئيناز داخل كندروسيت است. نقش مهمي در شكستن پپتيدهاي داخل سلولي داشته و در پاتوژنز بيماري هاي مختلف از جمله:

• سرطان پستان
• بيماري آلزايمر

موثر است اما نقش آن در تخريب پروتئوگليكان ماتريكس غضروف داخل مفصلي هنوز مشخص نشده است. به نظر ميرسد اين پروتئين در روند استخواني شدن اندوكندرال نقش داشته باشد. در مطالعه Bo و همكاران در بررسي پروتئوميكس سينوويال مبتلايان به استئوآرتريت و آرتريت روماتوئيد و مقايسه پروتئين ها، افزايش سطح كاتپسين در مقايسه با گروه شاهد گزارش شد.  افزايش آنزيم هاي تنظيم كننده ماتريكس در پاتوژنز بيماري ها از جمله استئوآرتريت ناشي از ورزش موثر است.

كاهش درصد كندروسيت هاي كاتپسين با ورزش زیاد

ورزش زياد نه تنها فنوتيپ تغييرات اوليه استئوآرتريت را باعث مي شود، بلكه به صورت غيرقابل انتظاري باعث كاهش درصد كندروسيت هاي كاتپسين مثبت خصوصا در غضروف مجاور به استخوان ساب كندرال می شود.  كاتپسين D از مهمترين پروتئین هاي مطرح شده در اين مطالعه است كه بيان تغيير يافته اين پروتئين با رويدادهايي مانند:

• اتصال اسكلت سلولي
• اختلال در پروتئين، آپوپتوز
• گليكوليز

سازگار است. در نتيجه نشان دهنده خطوط تحقيقات جديد در پاتوژنز استئوآرتريت مي باشد . در اين مطالعه كاهش كاتپسين در بيماران استئوآرتريت در راستاي نتايج مطالعه حاضر است. بنابراین بيان متفاوت اين پروتئين ها نشان دهنده توانايي 2-DE و SDS- PAGE در شناسايي كندروسيت بيماران مبتلا به استئوآرتريت است.

عدم وجود مطالعات كافي

با توجه به عدم وجود مطالعات كافي پروتئوميكس غضروف مفصلي، ضرورت انجام مطالعات بيشتر بر روي اين تركيب احساس مي شود. توصيه به انجام مطالعات وسيع تر به ويژه با استفاده از روش هاي دقيق تري همچون طيف سنجي جرمي بر روي اين پروتئين ها می شود. با شناخت بهتر پاتوژنز استئوآرتريت بتوان در پيشگيري و درمان اين بيماري شايع مفصل در آينده موفقيت هاي بيشتري كسب نمود.

منبع

زمانی، بتول، خسروی، غلامرضا، رضایی طاویرانی، مصطفی، هاشمی طاخونچه، مرضیه، و حیدری کشل، سعید. (1393). مقایسه پروتئومیکس کندروسیت غضروف بیماران مبتلا به استئوآرتریت با غضروف طبیعی. فیض، 18(2)، 160-166. SID. https://sid.ir/paper/40781/fa