ارزیابی  پس از فرآیند انجماد با تیمار آنتی اکسیدان میواینوزیتول در بیماران آستنوتراتوزواسپرمی فرآیند انجماد اسپرم شامل انکوباسیون اسپرم با مواد محافظ انجماد، کاهش دما به زیر صفر درجه سانتی‌گراد، ذخیره، ذوب، و سپس حذف ماده محافظ انجماد و بازگشت به حالت طبیعی فیزیولوژیکی است. انجماد اسپرم انسان به طور گسترده در برنامه‌های تلقیح مصنوعی و باروری آزمایشگاهی برای نگهداری اسپرم و افزایش شانس باروری به کار می‌رود. در این مقاله به بررسی ارزیابی پس از فرآیند انجماد با تیمار آنتی اکسیدان خواهیم پرداخت.

اهداف ذخیره بانک فریز اسپرم

بانک ذخیره فریز اسپرم برای چند هدف مورد استفاده قرار می‌گیرد: برای مردانی که باروری آن‌ها به واسطه وازکتومی، درمان با عوامل سیتوتوکسیک یا پرتودرمانی تحت تأثیر قرار گرفته است، و یا افرادی که اسپرم آن‌ها به واسطه شغلشان در معرض آسیب است. در فرآیند فریز، دمای سلول‌ها یا کل بافت به طور معمول تا منفی 196 درجه سانتی‌گراد کاهش می‌یابد.

ذخیره‌سازی طولانی‌ مدت اسپرم

ذخیره‌سازی طولانی‌مدت اسپرم از طریق مهار متابولیسم داخل‌سلولی انجام می‌شود. در واقع، در دمای منفی 196 درجه سانتی‌گراد، به دلیل عدم انرژی حرارتی کافی جهت واکنش‌های شیمیایی، در این دما اساساً هیچ فعالیت بیوشیمیایی رخ نمی‌دهد. علاوه بر این، محیط آبی که برای فعالیت‌های متابولیک سلول ضروری است، وجود ندارد. بنابراین، به علت عدم انرژی حرارتی کافی برای واکنش‌های شیمیایی و فقدان آب کافی که برای فرآیندهای متابولیک ضروری است، فعالیت‌های متابولیکی سلول متوقف می‌شود. با این حال، ممکن است بافت یا سلول‌های زنده طی فرایندهای فریز-ذوب دچار آسیب شوند. اثرات منفی فریز بر عملکرد اسپرم شامل:

• اختلال در تحرک
• حیات
• ساختار کروماتین
• غشای پلاسمایی اسپرم
• توانایی لقاح
• رشد و نمو اولیه جنین
• لانه‌گزینی
• کاهش میزان بارداری

می‌باشد. حدود 60 سال است که فرآیند انجماد به عنوان یک روش نگهدارنده از اسپرم برای طولانی‌ مدت مطرح شده و علیرغم تاریخچه طولانی انجماد اسپرم، میزان بقای اسپرم همچنان محدود است و نمی‌تواند انتظارات ایده‌آل را برآورده کند، زیرا

اختلالات انجماد با ایجاد آسیب‌های شیمیایی و فیزیکی

انجماد با ایجاد آسیب‌های شیمیایی و فیزیکی مانند تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در اسپرم سبب آسیب به غشای سلول، اختلال در:

• تحرک اسپرم
• ایجاد ناهنجاری‌های ریختی
• آسیب به آکروزوم
• قطعه‌ قطعه شدن DNA
• کاهش عملکرد اسپرم

می‌شود. امروزه تلاش‌های بسیاری در جهت بهبود و بهینه‌سازی تکنیک انجماد صورت گرفته است. یکی از این روش‌ها استفاده از آنتی‌اکسیدان‌هاست. میواینوزیتول، با نام شیمیایی Hexahydroxycyclohexane-1,2,3,4,5,6، ابتدا به عنوان فسفر فراوان در دانه‌های گیاهی و سایر بافت‌های گیاهی به نام فیتیک اسید توصیف شد. اغلب پژوهشگران پیشین از میواینوزیتول برای بهبود پارامترهای مایع منی حیوانات تحت شرایط انجماد و یا تنها برای بهبود پارامترهای اسپرم تحت شرایط لقاح آزمایشگاهی استفاده کرده‌اند. محققین در سال 2017 با مقایسه بین آنتی‌اکسیدان‌های میواینوزیتول، فرولیک اسید و ملاتونین در اسب، مشاهده کردند که بعد از فرآیند انجماد ذوب، تحرک اسپرم در گروه تیمار با میواینوزیتول افزایش بیشتری نسبت به سایر آنتی‌اکسیدان‌ها نشان داد. همچنین، با بررسی چندین آنتی‌اکسیدان از جمله میواینوزیتول بر اسپرم گاو منجمد-ذوب شده، به این مهم اشاره کردند که:

با افزایش زمان انکوبه‌کردن، میواینوزیتول سبب افزایش تحرک پیشرونده اسپرم می‌شود.

هدف از مطالعه

بررسی اثر آنتی‌اکسیدان میواینوزیتول و افزودن آن به محیط فریز اسپرم با ارزیابی پارامترهای اسپرمی، تمامیت غشای پلاسمایی، آسیب DNA و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم است. انتظار می‌رود که میواینوزیتول بتواند اثرات مخرب ناشی از استرس اکسیداتیو حاصل از فرآیند انجماد-ذوب را تا حد زیادی کاهش دهد. این مطالعه جامعه آماری شامل مردان نابارور است که پس از اعلام رضایت برای شرکت در مطالعه انتخاب شدند. نمونه‌های اضافی مایع منی 20 فرد از بین بیماران مرد نابارور (آستنوتراتوزواسپرمی) که توسط پزشک متخصص ارولوژیست تأیید شده، مطابق استانداردهای سازمان بهداشت جهانی پس از انجام اسپرموگرام جمع آوری شد. گروه‌ها شامل:

• گروه کنترل این گروه فاقد آنتی‌اکسیدان بوده و عمل انجماد بر روی آنها صورت نگرفت و تنها پس از 30 دقیقه ماندن در انکوباتور، پارامترهای مورد نظر اندازه‌گیری شد.
• گروه انجماد نمونه‌ها در این گروه همراه با محیط انجماد به نسبت 1:1 به مدت یک هفته در تانک نیتروژن مایع منجمد شدند. بعد از انجماد، نمونه‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد ذوب شدند و پس از ذوب، پارامترهای اسپرم اندازه‌گیری شد.
• گروه انجماد + میواینوزیتول ابتدا نمونه‌ها به مدت 1 ساعت همراه با آنتی‌اکسیدان میواینوزیتول با دوز 2mg/ml انکوبه شدند، سپس محیط انجماد با نسبت 1:1 اضافه و منجمد شدند و پس از ذوب، پارامترها اندازه گیری شدند.

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

بررسی پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 400x و طبق دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت 2010 صورت گرفت. شمارش اسپرم‌ها بر حسب میلیون بر لیتر توسط لام نئوبار انجام شد. بررسی میزان تحرک اسپرم‌ها براساس دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت 2010 انجام شد. در گروه بیماران آستنوتراتوزواسپرمی، درصد تحرک کل اسپرم کمتر از 40 درصد بود و مورفولوژی نرمال اسپرم‌ها کمتر از 4 درصد می‌باشد. برای بررسی مورفولوژی طبیعی اسپرم‌ها از روش رنگ آمیزی پاپانیکولا استفاده شد. ابتدا از هر نمونه گسترش تهیه شد، سپس رنگ آمیزی پاپانیکولا انجام شد. برای هر نمونه، یک لام فیکس شده از اسپرم تهیه شد و پس از رنگ آمیزی، 200 اسپرم توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100x بررسی شد.

ارزیابی میزان آسیب DNA اسپرم (روش هالواسپرم)

در این روش، تقریباً بین 15 تا 20 میلیون از نمونه‌های اسپرمی شستشو داده شد و مراحل انجام کار طبق دستورالعمل کیت انجام شد. با استفاده از این روش می‌توان میزان فراگمانتاسیون DNA را با توجه به وجود هالوهای اطراف هسته و اندازه آن بررسی نمود. در اسپرم‌های با فراگمانتاسیون DNA، هسته اسپرم با هالوهای کوچک و بدون هالو و در اسپرم‌های بدون فراگمانتاسیون DNA، هسته اسپرم با هالوهای بزرگ و هالوهای متوسط تعیین می‌شود. در این مطالعه، به منظور بررسی فراگمانتاسیون DNA، 200 سلول شمارش گردید.

ارزیابی تمامیت غشا سلول اسپرم (روش Host)

برای انجام این روش، ابتدا آماده‌سازی محلول هیپواسموتیک انجام شد. برای این منظور، 0.735 گرم سیترات سدیم و 1.351 گرم فروکتوز در 100 میلی لیتر آب دیونیزه حل گردید و محلول حاصل پس از تهیه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. جهت انجام آنالیز، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم به 1 میلی لیتر از محلول هیپواسموتیک اضافه و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس با قرار دادن یک قطره از سوسپانسیون سلولی حاصل بر روی لام و پوشاندن آن با لامل ارزیابی میکروسکوپی با بزرگنمایی 400x انجام شد و تعداد 100 اسپرم در هر لام شمارش می شود و نتایج به صورت درصد اسپرم با غشای پلاسمایی سالم گزارش شد.

ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم

با بررسی پتانسیل غشای میتوکندری (Mitochondrial Membrane Potential) با استفاده از رنگ آمیزی رودامین (123Rho) و بر اساس دستورالعمل ارائه شده انجام شد. در این روش، ابتدا به هر کدام از لوله‌های حاوی سوسپانسیون اسپرم، 5 میکرولیتر از رنگ رودامین 123 با غلظت نهایی 1 mg/ml اضافه و به مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و در شرایط تاریکی نگهداری شد. سپس محلول با دور 300 g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد. روی رسوب حاصل یک میلی‌لیتر از محلول PBS اضافه، با دور 300 g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی دور ریخته شد. در مرحله آخر روی رسوب حاصل یک میلی‌لیتر از محلول PBS اضافه شد.

پیپتاژ

بعد از پیپتاژ، چند میکرولیتر از سوسپانسیون روی لام قرار گرفت و بعد از تهیه گسترش، توسط میکروسکوپ فلورسانت مجهز به دوربین، با فیلتر مناسب با بزرگنمایی 1000x تعداد 100 اسپرم شمارش و اسپرم‌ها با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی به صورت درصد بیان شدند. در این روش:

• قطعه میانی اسپرم‌های با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی به صورت رنگ سبز درخشان
• میانی اسپرم‌های با پتانسیل غشای میتوکندری آسیب دیده به صورت غیردرخشان ظاهر می شود.

نتایج ارزیابی پس از فرآیند انجماد با تیمار آنتی اکسیدان

تحلیل آماری داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار، توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 21 و روش آنالیز واریانس یک‌ طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار میگیرد و تفاوت میانگین‌ها در سطح 0.05>P معنی‌دار در نظر گرفته شده است. تلاش برای قابلیت باروری اسپرم از حدود یک قرن پیش آغاز شده و یافته‌های مطالعات نشان می‌دهد که در طول روند انجماد-ذوب، به دلیل بروز استرس اکسیداتیو که در نتیجه به هم خوردن تعادل بین میزان رادیکال‌های آزاد اکسیژن و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی مایع منی ایجاد می‌شود، منجر به:

کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی مردان می‌شود.

نتایج مطالعه حاضر

در مطالعه حاضر، گروه انجماد کاهش معنی‌داری در تحرک کل، تحرک پیش‌رونده و تحرک غیرپیش‌رونده نسبت به گروه کنترل نشان داد. در صورتی که گروه درمان با میواینوزیتول افزایش معنی‌داری نسبت به گروه انجماد نشان داد. این مطالعه نشان داد که وجود میواینوزیتول در محیط vitro باعث افزایش کیفیت شاخص‌های اسپرم پس از انجماد-ذوب می‌گردد. میواینوزیتول یکی از پیش‌سازهای مهم برای مسیر سیگنالینگ فسفاتیدیل‌اینوزیتول است. از طرفی، اینوزیتول موجود در فسفاتیدیل‌اینوزیتول به صورت متوالی به polyphosphoinositides P2، PtdInsP و PtdIns تبدیل می‌شود. تحت محرک‌های خاص، PtdIns(4,5)P2 برای تولید پیام‌رسان‌های ثانویه مانند دی‌استیل‌گلیسرول (DAG) و 3(1,4,5)PIns هیدرولیز می‌شود که به ترتیب در:

• فسفوریلاسیون پروتئین
• تعدیل کلسیم داخل‌ سلولی

نقش دارند. بنابراین با ورود کلسیم به داخل غشای فلاژلوم، تحرک اسپرم افزایش می‌یابد. لذا افزودن این ماده به محیط انجماد اسپرم منجر به افزایش و بهبود پارامترهای تحرک می‌گردد. از طرفی اسپرم غنی از میتوکندری است که به عنوان یک منبع انرژی برای تحرک اسپرم عمل می‌کند. ROS سبب آسیب به غشای میتوکندری و القای استرس اکسیداتیو در آن می‌شود. استرس اکسیداتیو باعث تخلیه ATP می‌شود که خود موجب کاهش انرژی در دسترس و همچنین منجر به کاهش فسفوریلاسیون پروتئین آکسونمال و در نهایت کاهش تحرک اسپرم می‌گردد.

نتیجه گیری

مطالعه پیش‌رو نشان داد که میواینوزیتول باعث افزایش معنی‌دار در پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم و تحرک و بهبود کیفیت شاخص‌های اسپرم پس از انجماد-ذوب می‌گردد.